Last updated: September 12, 2025

siRNA transfection

试剂

siRNA（公司一般会提供3种siRNA，1个通用阴性对照，1个FAM标记通用阴性对照，1个GAPDH阳性对照）
转染试剂为Lipo2000或Lipo3000
Opti-MEM，或者简单化为无抗生素无血清培养基（特殊的，若转染BMDM的话，需补充20ng/mL的M-CSF）

环境

siRNA长期放置最好以冻干粉形式保存，可保存1年以上。第一次溶解时先勿开盖，在1000g，4°C离心1min后，用DEPC水溶解至20pmol/μL（推荐值），分装保存，避免反复冻融，-20°C至-80°C可保存半年以上。
siRNA最好冰上放置，整个实验过程，要求RNA酶free，枪头、EP管等都应该经过无酶处理。

转染前准备

至少3个平行重复
推荐转染使用的细胞密度为70%-80%
建议转染前12h更换细胞培养基为Opti-MEM

转染步骤

以下步骤以24孔板为例，所有用量和体积均按每孔给出。对于其他规格，请参见{# https://github.com/gohugoio/hugo/blob/master/tpl/tplimpl/embedded/templates/_markup/render-link.html #}“扩大或缩小转染规模”。

稀释siRNA：在无菌管中加入50μL的Opti-MEM，再加入20pmol的siRNA低聚体，用移液枪轻轻混匀，室温静置5min。
稀释转染试剂：在另一无菌管中加入50μL的Opti-MEM，再加入1μL的Lipo2000，用移液枪轻轻混匀，室温静置5min。
将已稀释的Lipo2000加入到已稀释的siRNA低聚体中，用移液枪轻轻混匀，室温静置15min。（不能静置超过30min，最好15min后立即加入孔板）
将siRNA低聚体-Lipo2000复合物添加至孔板中，轻轻晃动细胞板至均匀分布。
根据后续实验需求在培养箱中孵育细胞24-96小时。24-48h检测mRNA表达（qRT-PCR），48-96h检测蛋白表达（Western Blot）。
可在6-8h更换为完全培养基，避免细胞长时间饥饿造成的细胞活力损失。

扩大或缩小转染规模

Culture vessel	Surf. area per well¹	Vol. of plating medium	Vol. of dilution medium²	RNA	Lipofectamine 2000
96-well	0.3 cm ²	100 µl	2 x 25 µl	5 pmol	0.25 µl
24-well	2 cm ²	500 µl	2 x 50 µl	20 pmol	1.0 µl
12-well	4 cm ²	1 ml	2 x 100 µl	40 pmol	2.0 µl
6-well	10 cm ²	2 ml	2 x 250 µl	100 pmol	5 µl
60-mm	20 cm ²	5 ml	2 x 0.5 ml	200 pmol	10 µl
10-cm	60 cm ²	15 ml	2 x 1.5 ml	600 pmol	30 µl

¹ Surface areas may vary depending on the manufacturer.
² Volumes of dilution medium in Step 2a & 2b of DNA or RNAi transfection protocols.

Reference

{# https://github.com/gohugoio/hugo/blob/master/tpl/tplimpl/embedded/templates/_markup/render-link.html #}Lipofectamine 2000
{# https://github.com/gohugoio/hugo/blob/master/tpl/tplimpl/embedded/templates/_markup/render-link.html #}Guidelines for RNA Transfection
{# https://github.com/gohugoio/hugo/blob/master/tpl/tplimpl/embedded/templates/_markup/render-link.html #}Optimizing siRNA Transfection
{# https://github.com/gohugoio/hugo/blob/master/tpl/tplimpl/embedded/templates/_markup/render-link.html #}Selecting an RNAi Strategy